La face . .

 | 
 

  ( )

         


avatar

: 29
: 05/12/2008

: ( )    13, 2010 4:37 am

Exercice 7 : Une enzyme a t purifie en trois tapes, en partant de 1000 g d'un extrait brut contenant au total 20000 units de cette enzyme.

Questions :

1 - Complter le tableau ci-dessous :


protine (g) :

activit (UE) :
taux de purification :
rendement :
Extrait brut

1000
20000
Chromato. d'exclusion

200
14000
Chromato. d'change d'ions

15
4500
Chromato. d'affinit

0,5
3500


2 - Quelles conclusions peut on tirer de cette tude ?

Exercice 8 : Un mlange de trois acides amins : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est soumis une chromatographie sur colonne changeuse de cations. L'lution est effectue l'aide d'un tampon pH = 6.

Question :

1 - Dans quel ordre peut-on prvoir la sortie de ces acides amins

Exercice 9 :
Un mlange d'immunoglobulines G (MM = 160000 Da) et d'albumine srique bovine (MM = 67000 Da) est dpos sur colonne de sphadex G-100 (limite d'exclusion = 100000 Da).

Rappel : MM = masse molculaire.

Question :

1 - Tracer un diagramme d'lution vraisemblable (DO en fonction de Ve) en indiquant le volume mort

Exercice 3 : le caoutchouc naturel
Lisoprne a pour formule C5H8.
Le caoutchouc naturel, produit par lhva, est un assemblage en chane de molcules disoprne.
Les macromolcules de caoutchouc ont pour formule (C5H8)y, avec y entier.
1) Calculer la masse molaire molculaire de lisoprne.
2) Quelle quantit de matire disoprne y a-t-il dans 6800 g de caoutchouc naturel ?
3) Une macromolcule de caoutchouc naturel a pour masse molaire M = 204 000 g.mol-1. Dterminer le nombre y de molcules disoprne constituant la chane de cette macromolcule
Exercice 3 :
La carboxymthylcellulose (CM-cellulose) est un support changeur de cations. Elle est obtenue en substituant la cellulose par des groupements carboxymthyls (-CH2-COOH).

Questions :

1 - Quelle est la proportion des groupements carboxymthyls chargs ngativement aux pH suivants : 1 ; 4,76 ; 7 et 9 (on considrera que le pKa du groupement carboxyl des radicaux carboxymthyls est 4,76).

2 - Parmi les protines suivantes : Ovalbumine (pHi = 4,6), Cytochrome c (pHi = 10,65) et Lysozyme (pHi = 11), quelles sont celles qui sont retenues par la CM-cellulose pH 7 ? (On considrera que les interactions protine-CM-cellulose sont uniquement d'ordre lectrostatiques).

Exercice 2 :
On veut sparer 3 acides-amins : l'acide L-glutamique, la L-leucine et la L-lysine par chromatographie sur une rsine polystyrnique substitue par des groupements sulfonate (-SO3-). Les pH isolectriques de l'acide L-glutamique, de la L-leucine et de la L-lysine sont respectivement : 3,22 ; 5,98 ; 9,74, 25 C.

On dpose ces 3 acides amins sur la colonne, pH 2, puis on lue en amenant progressivement le pH 7.

Question :

1 - Quels acides amins sont lus et dans quel ordre ? (On considrera que les interactions acide amin-rsine sont uniquement d'ordre lectrostatiques).

. Exercice 5 : Le coefficient de partage de l'iode (I2
) entre les deux solvants non-miscibles : ttrachloromthane et eau, est gal 100 25 C. À 10 ml de solution aqueuse d'iode 10 g/l, on ajoute 10 ml de ttrachloromthane (CCl4).

Donne :
I2
est plus soluble dans le ttrachloromthane que dans l'eau.


Question : Dterminer la concentration en iode dans le ttrachloromthane et dans l'eau, aprs agitation et dcantation

Exercice 4 : La dithylaminothylcellulose (DEAE-cellulose) est un support changeur d'anions, obtenu en substituant la cellulose par des groupements dithylaminothyls :

CH2-CH3

/
-CH2-CH2- NH+


\

CH2-CH3



Questions :

1 - Quelle est la proportion de radicaux-DEAE chargs positivement aux pH suivants : 2 ; 7 ; 9,4 ; 12 ? (On considrera que le pK de l'amine tertiaire du groupement DEAE est 9,4).

2 - Parmi les protines suivantes : Srumalbumine (pHi = 4,9), Urase (pHi = 5), Chymotrypsinogne (pHi = 9,5), quelles sont celles qui, pH 7, sont retenues par la DEAE-cellulose ? (On considrera que les interactions protine-DEAE-cellulose sont uniquement de type lectrostatiques).

. Exercice 6 : On veut dterminer la masse molculaire (MM) d'une protine p par chromatographie d'exclusion. La limite d'exclusion du gel se situe entre 40000 et 400000 de MM.

L'talonnage du gel se fait par diverses substances, dont les MM (exprimes en Daltons) et les volumes d'lution (Ve, exprim en ml) sont indiqus dans le tableau suivant :


MM (Da)

Ve (ml)
Dextran

2000000
45
Fibrinogne

340000
60
Catalase

230000
75
Lactoglobuline

19000
132


Questions :

1 - Rappeler quoi correspond le Dalton.

2 - La protine p montre, quant elle, un volume d'lution Ve = 113 ml. Dterminer sa MM

Exercice 11 : Soit un mlange de 2 polypeptides A et B, et d'un octapeptide C. La composition globale en acides amins, pour chacun de ces peptides, est la suivante :


Nombre de rsidus :

pKa
peptide A
peptide B
peptide C
Arg

12
8
12
2
Lys

10
12
16
1
Glu + Asp

4,5
13
10
-
His

6
2
8
-
Cys

8
2
1
1
a - NH2

7,8
2
1
1
a - COOH

3,8
2
1
1


Questions :

1 - Que peut on dire du peptide A ?

2 - A pH = 4,5, quelles sont les charges globales de A, B et C ?

3 - On veut sparer ces trois composs par chromatographie changeuse d'ions. Quel type de rsine allez-vous choisir ?

4 - A pH = 4,5, ces composs sont-ils fixs sur la rsine ? Comment luer les produits fixs ? Quel sera l'ordre d'lution des composs retenus ? A quel pH lue t'on le peptide C ? Conclusions

Exercice 10 : On veut raliser la sparation de 5 acides amins (Glu, Met, Tyr, Lys, Ser). On utilise pour cela 5 g de rsine sche de polystyrne sulfon que l'on dispose dans une colonne ouverte. La rsine est lave par une solution d'HCl (1 M) en excs. Aprs ce traitement, la rsine est lave l'eau distille. On fait alors passer une solution de NaCl (2 M) en excs. Le filtrat correspondant est recueillit dans sa totalit et est dos par 11,5 ml de NaOH (1 M).

Questions :

1 - Commenter les oprations effectues (crire sommairement les quations mises en jeu) et en dduire la capacit de rtention de la rsine.

2 - Les 5 acides amins sparer sont solubiliss dans un tampon pH = 3,8. A ce pH, quels sont les composs qui seront retenus sur la rsine ?

3 - Aprs avoir charg la colonne par les 5 acides amins pralablement solubiliss dans le tampon pH 3,8, l'lution est ralise en gradient de pH, en augmentant le pH. Dans quel ordre les acides amins vont-ils tre lus ?

On se servira des donnes ci-aprs :


acide amin :

pK - COOH
pK - NH2
pK -R
Glu

2,19
9,67
4,25
Met

2,28
9,21
-
Tyr

2,20
9,11
10,07
Lys

2,18
8,95
10,53
Ser

2,21
9,15
-




Exercices de chromatographie :





Correction exercice 8 :

Un mlange de trois acides amins : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est soumis une chromatographie sur colonne changeuse de cations. L'lution est effectue l'aide d'un tampon pH = 6.


Question : dans quel ordre peut-on prvoir la sortie de ces acides amins ?

Si les trois acides amins ont t retenus sur la colonne, c'est que la charge de la colonne a t ralise un pH infrieur au plus petit des pHi, soit un pH infrieur 2,87, afin que les acides amins se prsentent sous une forme charge positivement et qu'ils puissent tre retenus sar la rsine changeuse de cations, charge ngativement.



Acide amin :

pHi
Charge pH < 2,87
Charge pH 6
Asp
2,87
+
-
Leu
6
+
neutre (50%/50%)
Arg
10,76
+
+


&Agrave; un pH de 6, Asp est charg ngativement; il est donc lu de la colonne. La leucine est ensuite lue. L'Arginine, toujours charge positivement pH = 6 reste sur la colonne et n'est donc pas lue.


Exercice 15 : Un corps gras naturel, constitu d'un mlange de triglycrides (TG) est analys en chromatographie sur couche mince. La plaque de gel de silice est uniformment imprgne de nitrate d'argent (AgNO3) puis mise scher 1 heure, avant d'effectuer les dpts analyser. Les sels d'argent sont en effet capables de former une liaison non covalente et rversibles avec les chanes carbone insatures (prsentant des doubles liaisons)



1 : Tmoin tri-starine
2 : Tmoin di-olo-starine
3 : Echantillon du corps gras


La plaque est ensuite place dans une cuve de chromatographie. Le solvant de migration est le chlorure de mthylne.

On rappelle :

ac. laurique : (C12:0)
ac. myristique : (C14:0)
ac. palmitique : (C16:0)
ac. starique : (C18:0)

Exercices de chromatographie :





Exercice 13 : Sparation des esters mthyliques d'acides gras.

L'estrification des acides gras d'un corps gras naturel (un mlange de triglycrides) peut tre ralise en incubant le corps gras avec du trifluorure de bore (catalyseur de la raction) dans le mthanol (CH3-OH, donneur des groupements mthyls), 100C durant 15 min.

Le chromatogramme ci-dessous reprsente le profil d'lution d'esters mthyliques d'acides gras saturs et insaturs repris dans l'hexane aprs injection en chromatographie en phase gazeuse. Le temps de rtention (tr) est indiqu en minutes, au-dessus de chaque pic :




tr :
aire (%) :
8.98
30.783
17.16
15.976
19.00
29.293
22.90
14.636
29.32
8.761


Questions :

1 - Quel est le principe de la chromatographie utilise ? Il existe deux techniques pour une telle chromatographie. Donnez en les principes en quelques lignes.

2 - Le standard interne est ici l'acide starique (C18:0) qui prsente un temps de rtention de 17,16 minutes. A l'aide du tableau ci-dessous, dterminer la nature des autres acides gras lus. Que reprsente le premier pic (tr : 1,7 min) ? Selon quel(s) critre(s) les acides gras sont-ils lus ?


acide gras :
rapport tr / tr C18:0 :
ac. laurique (C12:0)
0,12
ac. myristique (C14:0)
0,25
ac. palmitique (C16:0)
0,53
ac. starique (C18:0)
1
ac. olique (C18:1 ; 9)
1,11
ac. linolique (C18:2 ; 9, 12)
1,33
ac. linolnique (C18:3 ; 9, 12, 15)
1,71
ac. arachidique (C20:0)
1,88
ac. arachidonique (C20:4 ; 5, 8, 11, 14)
3,24


3 - Calculer la masse des diffrents produits dans l'chantillon, sachant que l'on a inject 132 microgrammes d'esters mthyliques d'acides gras saturs et insaturs.


Exercices de chromatographie :





Exercice 16 : Marquage radioactif d'une sonde nuclotidique :


Lors du criblage d'une banque (d'ADNc ou gnomique) ou de la ralisation d'un northern blot, southern blot, ou pour des expriences d'hybridation in situ, il est ncessaire de raliser une sonde nuclotidique radiomarque au 32P.

Le marquage d'une squence d'ADN est ralis par la technique de "random-priming" (multi-amorage au hasard) qui utilise un mlange de courts oligonuclotides (6 9 nuclotides) comportant une combinaison de toutes les squences possibles.

Le marquage radioactif (incorporation d'ATP marqu par le 32P) s'effectue aprs dnaturation de la squence d'ADN double brin qui va tre utilise comme matrice, et appariement du mlange de courts oligonuclotides.

L'enzyme T4 ADN polymrase va permettre la polymrisation en 5' des amorces, dans le sens 5' vers 3'.

La squence d'ADN est incube 30 min 37 C en prsence de 32P doxy-ATP.et des 3 autres nuclotides (dCTP, dGTP, dTTP) non radiomarqus. Ceci conduit la synthse d'un mlange d'amorces radiomarques de quelques centaines de nuclotides de long.




Le mlange ractionnel ainsi obtenu est charg sur une colonne de Sphadex G-50, des fractions de 100 ml sont recueillies et la radioactivit est compte ( voir tableau ci-aprs).




Fraction

cpm/ml
1
100
2
150
3
700
4
1000
5
630
6
140
7
480
8
1200
9
1500
10
1300
11
750
12
470
13
130

Schma tir de : Biologie molculaire et mdecine - JC. Kaplan, M. Delpech - Mdecine-Sciences Flammarion.


Questions :

1 - Quel est le type de chromatographie employ ici ? Donner son principe (une demi-page).

2 - Tracer le diagramme exprimant la radioactivit en fonction du n de fraction. A quoi correspond le premier pic de radioactivit ? A quoi correspond le second pic ? Quelle(s) fraction(s) allez vous rcuprer afin de vous en servir comme sonde radiomarque ?

3 - Quel est le volume mort de la colonne ?


Exercices de chromatographie :





Exercice 14 : Un corps gras naturel constitu d'un mlange de triglycrides (TG), est soumis l'action de la lipase pancratique. Cette enzyme permet l'hydrolyse des acides gras en position 1 et 3 des TG, ce qui mne des acides gras libres (AGL) et des 2-monoglycrides (2-MG), lorsque la raction est totale. Les AGL ont t purifis partir du lipolysat par chromatographie changeuse d'anions. Cette chromatographie permet, outre la fraction AGL, de purifier une seconde fraction constitue de glycrides neutres (GN). Diffrents chantillons ont t analyss en chromatographie sur couche mince (gel de silice). Le mlange de solvant utilis, de polarits diffrentes, tant : ther de ptrole / ther dithylique.



Les dpts effectus sont :

1 : Tmoin Triglycrides (TG)
2 : Tmoin 1, 2-Diglycrides et 1, 3-Diglycrides (DG)
3 : Tmoin Monoglycrides (MG)
4 : Tmoin Acides Gras
5 : Echantillon milieu de lipolyse
6 : Echantillon Fraction Glycrides Neutres (GN) provenant de la chromatographie changeuse d'anions
7 : Echantillon Fraction Acides Gras Libres (AGL) provenant de la chromatographie changeuse d'anions


Questions :

1 - Donner en quelques lignes le principe de la chromatographie sur couche mince utilise. En fonction de quel(s) critre(s) les diffrents composs vont-ils tre spars ?

2 - Ecrire la raction mettant en jeu les TG et la lipase pancratique.

3 - Analyser le chromatogramme ci-dessus. Est-ce que la raction de lipolyse est totale ?


Exercices de chromatographie :





Exercice 17 : L'expression d'une protine dans une bactrie (Escherichia coli le plus souvent) permet l'obtention d'un taux lev de protines pures. Le plasmide pET-15 de la socit Novagen permet l'expression inductible de protines recombinantes porteuses d'une extension N-terminale de 6 rsidus histidine (His).

Cette squence poly-His est capable de se lier des ions nickel divalents (Ni2+) immobiliss sur un gel de cellulose ou d'agarose. Un extrait bactrien brut, aprs induction de l'expression de la protine recombinante, peut tre charg directement sur une colonne contenant ce type de rsine, et aprs une tape de lavage, la protine retenue peut tre lue par de l'imidazole. Cette rsine peut tre rgnre et rutilise.




La figure reprsente un gel SDS-PAGE color par le bleu de Coomassie, o l'on a spar les chantillons suivants :

1 - Lysat brut de bactries transfectes par le plasmide pET-15 contenant un insert d'ADNc
2 - Protines non retenues sur la colonne
3 - Lavage
4 - Protine lue

Questions :

1 - Quel est le type de chromatographie utilis ? Expliquer le principe en une demi-page.
2 - Commenter le gel SDS-PAGE. Dterminer la masse molculaire de la protine lue.


Exercices de chromatographie :





Correction exercice 16 :

1 - Le type de chromatographie utolis ici est la chromatographie d'exclusion, ou tamisage molculaire, gel filtration. (Faire un schma).

2 - On peut tracer directement le nombre de cpm / ml en fonction du numro des fractions, ou bien le nombre de cpm par fraction, en fonction du numro des fractions (ce que l'on a fait ci-desous.






  • Le premier pic correspond des composs exclus du gel, donc de haute masse molculaire : la sonde radiomarque.

  • Le second pic correspond des composs retenus dans le maillage du gel d'exclusion : les nuclotides libres : le 32P dATP ainsi que le dCTP, le dGTP et le dTTP.

  • Les fractions 3, 4 et 5 sont mlanges afin de constituer la sonde.

3 - Rappel : le volume mort est le volume d'lution des composs dont le diamtre est suprieur celui des pores du gel d'exclusion. Ici, cela correspond la quatrime fraction. Le volume mort est donc de 400 microlitres.
Exercices de chromatographie :






Correction exercice 4 :

1 - Proportion des groupements dithylaminothyls (DEAE : pKa = 9,4) chargs ngativement aux pH : 2, 7, 9,4 et 12.

Le pH est donn par la relation suivante :






&Agrave; pH = 2 :

= pH - pKa = 2 - 9,4 = -7,4 donc :

= 3,98 10-6

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10-6.(A), on en dduit que (A) + 3,98 10-6.(A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 3,98 10-6)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = environ 100 % et (B) = 0 %






&Agrave; pH = 7 :

= pH - pKa = 7 - 9,4 = -2,4 donc :

= 3,98 10-3

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10-3.(A), on en dduit que (A) + 3,98 10-3.(A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 3,98 10-3)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,996 % et (B) = 0,004 %






&Agrave; pH = 9,4 :

= pH - pKa = 9,4 - 9,4 = 0 donc :

= 1

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A), on en dduit que (A) + (A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(2)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 %






&Agrave; pH = 12 :

= pH - pKa = 12 - 9,4 = 2,6 donc :

= 398,1

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 398,1(A), on en dduit que (A) + 398,1(A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 398,1)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,25 % et (B) = 99,75 %



Globalement, on peut donc constater qu' un pH infrieur au pKa (pH acide), les groupements dithylaminothyls se prsenteront majoritairement sous forme acide (-NH+).

&Agrave; l'inverse, un pH suprieur au pKa (pH basique), les groupements dithylaminothyls se prsenteront majoritairement sous forme basique (-N)



2 - &Agrave; pH = 7, on a pu calculer que la rsine tait 99,996 % sous forme acide, charge positivement.


Protine :

Srumalbumine
Urase
Chymotrypsinogne

pHi :

4,9
5
9,5

Charge ph = 7 :

ngative
ngative
positive



Ainsi, pH = 7 la srumalbumine et l'urase sont charges ngativement, et seront donc retenues sur la colone. Le chymotrypsinogne ne sera pas retenus.

    
 
( )
          
1 1

:
 ::   ::  -