اميرة الاخلاق
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 |  موضوع: تمارين لشعبة تقني رياضي (هندسة الطرائق)  السبت مارس 13, 2010 4:37 am | |
| Exercice 7 : Une enzyme a été purifiée en trois étapes, en partant de 1000 g d'un extrait brut contenant au total 20000 unités de cette enzyme.
Questions :
1 - Compléter le tableau ci-dessous :
protéine (g) : activité (UE) :taux de purification :rendement :Extrait brut
100020000Chromato. d'exclusion
20014000Chromato. d'échange d'ions
154500Chromato. d'affinité
0,53500 2 - Quelles conclusions peut on tirer de cette étude ?Exercice 8 : Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations. L'élution est effectuée à l'aide d'un tampon à pH = 6.
Question :
1 - Dans quel ordre peut-on prévoir la sortie de ces acides aminés
Exercice 9 : Un mélange d'immunoglobulines G (MM = 160000 Da) et d'albumine sérique bovine (MM = 67000 Da) est déposé sur colonne de séphadex G-100 (limite d'exclusion = 100000 Da).
Rappel : MM = masse moléculaire.
Question :
1 - Tracer un diagramme d'élution vraisemblable (DO en fonction de Ve) en indiquant le volume mort
Exercice 3 : le caoutchouc naturel
L’isoprène a pour formule C5H8.
Le caoutchouc naturel, produit par l’hévéa, est un assemblage en chaîne de molécules d’isoprène.
Les macromolécules de caoutchouc ont pour formule (C5H8)y, avec y entier.
1) Calculer la masse molaire moléculaire de l’isoprène.
2) Quelle quantité de matière d’isoprène y a-t-il dans 6800 g de caoutchouc naturel ?
3) Une macromolécule de caoutchouc naturel a pour masse molaire M = 204 000 g.mol-1. Déterminer le nombre y de molécules d’isoprène constituant la chaîne de cette macromolécule
Exercice 3 : La carboxyméthylcellulose (CM-cellulose) est un support échangeur de cations. Elle est obtenue en substituant la cellulose par des groupements carboxyméthyls (-CH2-COOH).
Questions :
1 - Quelle est la proportion des groupements carboxyméthyls chargés négativement aux pH suivants : 1 ; 4,76 ; 7 et 9 (on considérera que le pKa du groupement carboxyl des radicaux carboxyméthyls est 4,76).
2 - Parmi les protéines suivantes : Ovalbumine (pHi = 4,6), Cytochrome c (pHi = 10,65) et Lysozyme (pHi = 11), quelles sont celles qui sont retenues par la CM-cellulose à pH 7 ? (On considérera que les interactions protéine-CM-cellulose sont uniquement d'ordre électrostatiques).
Exercice 2 : On veut séparer 3 acides-aminés : l'acide L-glutamique, la L-leucine et la L-lysine par chromatographie sur une résine polystyrénique substituée par des groupements sulfonate (-SO3-). Les pH isoélectriques de l'acide L-glutamique, de la L-leucine et de la L-lysine sont respectivement : 3,22 ; 5,98 ; 9,74, à 25 °C.
On dépose ces 3 acides aminés sur la colonne, à pH 2, puis on élue en amenant progressivement le pH à 7.
Question :
1 - Quels acides aminés sont élués et dans quel ordre ? (On considérera que les interactions acide aminé-résine sont uniquement d'ordre électrostatiques).
. Exercice 5 : Le coefficient de partage de l'iode (I2) entre les deux solvants non-miscibles : tétrachlorométhane et eau, est égal à 100 à 25 °C. À 10 ml de solution aqueuse d'iode à 10 g/l, on ajoute 10 ml de tétrachlorométhane (CCl4).
Donnée : I2 est plus soluble dans le tétrachlorométhane que dans l'eau.
Question : Déterminer la concentration en iode dans le tétrachlorométhane et dans l'eau, après agitation et décantation
Exercice 4 : La diéthylaminoéthylcellulose (DEAE-cellulose) est un support échangeur d'anions, obtenu en substituant la cellulose par des groupements diéthylaminoéthyls :
CH2-CH3
/
-CH2-CH2- NH+
\
CH2-CH3
Questions :
1 - Quelle est la proportion de radicaux-DEAE chargés positivement aux pH suivants : 2 ; 7 ; 9,4 ; 12 ? (On considérera que le pK de l'amine tertiaire du groupement DEAE est 9,4).
2 - Parmi les protéines suivantes : Sérumalbumine (pHi = 4,9), Uréase (pHi = 5), Chymotrypsinogène (pHi = 9,5), quelles sont celles qui, à pH 7, sont retenues par la DEAE-cellulose ? (On considérera que les interactions protéine-DEAE-cellulose sont uniquement de type électrostatiques).. Exercice 6 : On veut déterminer la masse moléculaire (MM) d'une protéine p par chromatographie d'exclusion. La limite d'exclusion du gel se situe entre 40000 et 400000 de MM.
L'étalonnage du gel se fait par diverses substances, dont les MM (exprimées en Daltons) et les volumes d'élution (Ve, exprimé en ml) sont indiqués dans le tableau suivant :
MM (Da) Ve (ml)Dextran
200000045Fibrinogène
34000060Catalase
23000075Lactoglobuline
19000132
Questions :
1 - Rappeler à quoi correspond le Dalton.
2 - La protéine p montre, quant à elle, un volume d'élution Ve = 113 ml. Déterminer sa MM
Exercice 11 : Soit un mélange de 2 polypeptides A et B, et d'un octapeptide C. La composition globale en acides aminés, pour chacun de ces peptides, est la suivante :
Nombre de résidus :
pKa
peptide A
peptide B
peptide C
Arg
12
8
12
2
Lys
10
12
16
1
Glu + Asp
4,5
13
10
-
His
6
2
8
-
Cys
8
2
1
1
a - NH2
7,8
2
1
1
a - COOH
3,8
2
1
1
Questions :
1 - Que peut on dire du peptide A ?
2 - A pH = 4,5, quelles sont les charges globales de A, B et C ?
3 - On veut séparer ces trois composés par chromatographie échangeuse d'ions. Quel type de résine allez-vous choisir ?
4 - A pH = 4,5, ces composés sont-ils fixés sur la résine ? Comment éluer les produits fixés ? Quel sera l'ordre d'élution des composés retenus ? A quel pH élue t'on le peptide C ? ConclusionsExercice 10 : On veut réaliser la séparation de 5 acides aminés (Glu, Met, Tyr, Lys, Ser). On utilise pour cela 5 g de résine sèche de polystyrène sulfoné que l'on dispose dans une colonne ouverte. La résine est lavée par une solution d'HCl (1 M) en excès. Après ce traitement, la résine est lavée à l'eau distillée. On fait alors passer une solution de NaCl (2 M) en excès. Le filtrat correspondant est recueillit dans sa totalité et est dosé par 11,5 ml de NaOH (1 M).
Questions :
1 - Commenter les opérations effectuées (écrire sommairement les équations mises en jeu) et en déduire la capacité de rétention de la résine.
2 - Les 5 acides aminés à séparer sont solubilisés dans un tampon à pH = 3,8. A ce pH, quels sont les composés qui seront retenus sur la résine ?
3 - Après avoir chargé la colonne par les 5 acides aminés préalablement solubilisés dans le tampon à pH 3,8, l'élution est réalisée en gradient de pH, en augmentant le pH. Dans quel ordre les acides aminés vont-ils être élués ?
On se servira des données ci-après :
acide aminé :
pK - COOHpK - NH2pK -RGlu
2,199,674,25Met
2,289,21-Tyr
2,209,1110,07Lys
2,188,9510,53Ser
2,219,15-Exercices de chromatographie : Correction exercice 8 :
Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations. L'élution est effectuée à l'aide d'un tampon à pH = 6.
Question : dans quel ordre peut-on prévoir la sortie de ces acides aminés ?
Si les trois acides aminés ont été retenus sur la colonne, c'est que la charge de la colonne a été réalisée à un pH inférieur au plus petit des pHi, soit un pH inférieur à 2,87, afin que les acides aminés se présentent sous une forme chargée positivement et qu'ils puissent être retenus sar la résine échangeuse de cations, chargée négativement.
Acide aminé : pHiCharge à pH < 2,87Charge à pH 6Asp2,87 +- Leu6 + neutre (50%/50%) Arg10,76 + + À un pH de 6, Asp est chargé négativement; il est donc élué de la colonne. La leucine est ensuite éluée. L'Arginine, toujours chargée positivement à pH = 6 reste sur la colonne et n'est donc pas éluée.Exercice 15 : Un corps gras naturel, constitué d'un mélange de triglycérides (TG) est analysé en chromatographie sur couche mince. La plaque de gel de silice est uniformément imprégnée de nitrate d'argent (AgNO3) puis mise à sécher 1 heure, avant d'effectuer les dépôts à analyser. Les sels d'argent sont en effet capables de former une liaison non covalente et réversibles avec les chaînes carbonée insaturées (présentant des doubles liaisons)
 1 : Témoin tri-stéarine
2 : Témoin di-oléo-stéarine
3 : Echantillon du corps gras
La plaque est ensuite placée dans une cuve de chromatographie. Le solvant de migration est le chlorure de méthylène.
On rappelle :
ac. laurique : (C12:0)
ac. myristique : (C14:0)
ac. palmitique : (C16:0)
ac. stéarique : (C18:0)
Exercices de chromatographie : Exercice 13 : Séparation des esters méthyliques d'acides gras.
L'estérification des acides gras d'un corps gras naturel (un mélange de triglycérides) peut être réalisée en incubant le corps gras avec du trifluorure de bore (catalyseur de la réaction) dans le méthanol (CH3-OH, donneur des groupements méthyls), à 100°C durant 15 min.
Le chromatogramme ci-dessous représente le profil d'élution d'esters méthyliques d'acides gras saturés et insaturés repris dans l'hexane après injection en chromatographie en phase gazeuse. Le temps de rétention (tr) est indiqué en minutes, au-dessus de chaque pic :
tr :
aire (%) :
8.98
30.783
17.16
15.976
19.00
29.293
22.90
14.636
29.32
8.761
Questions :
1 - Quel est le principe de la chromatographie utilisée ? Il existe deux techniques pour une telle chromatographie. Donnez en les principes en quelques lignes.
2 - Le standard interne est ici l'acide stéarique (C18:0) qui présente un temps de rétention de 17,16 minutes. A l'aide du tableau ci-dessous, déterminer la nature des autres acides gras élués. Que représente le premier pic (tr : 1,7 min) ? Selon quel(s) critère(s) les acides gras sont-ils élués ?
acide gras :
rapport tr / tr C18:0 :
ac. laurique (C12:0)
0,12
ac. myristique (C14:0)
0,25
ac. palmitique (C16:0)
0,53
ac. stéarique (C18:0)
1
ac. oléique (C18:1 ; 9)
1,11
ac. linoléique (C18:2 ; 9, 12)
1,33
ac. linolénique (C18:3 ; 9, 12, 15)
1,71
ac. arachidique (C20:0)
1,88
ac. arachidonique (C20:4 ; 5, 8, 11, 14)
3,24
3 - Calculer la masse des différents produits dans l'échantillon, sachant que l'on a injecté 132 microgrammes d'esters méthyliques d'acides gras saturés et insaturés. Exercices de chromatographie : Exercice 16 : Marquage radioactif d'une sonde nucléotidique :
Le marquage d'une séquence d'ADN est réalisé par la technique de "random-priming" (multi-amorçage au hasard) qui utilise un mélange de courts oligonucléotides (6 à 9 nucléotides) comportant une combinaison de toutes les séquences possibles.
Le marquage radioactif (incorporation d'ATP marqué par le 32P) s'effectue après dénaturation de la séquence d'ADN double brin qui va être utilisée comme matrice, et appariement du mélange de courts oligonucléotides.
L'enzyme T4 ADN polymérase va permettre la polymérisation en 5' des amorces, dans le sens 5' vers 3'.
La séquence d'ADN est incubée 30 min à 37 °C en présence de 32P déoxy-ATP.et des 3 autres nucléotides (dCTP, dGTP, dTTP) non radiomarqués. Ceci conduit à la synthèse d'un mélange d'amorces radiomarquées de quelques centaines de nucléotides de long.
Le mélange réactionnel ainsi obtenu est chargé sur une colonne de Séphadex G-50, des fractions de 100 ml sont recueillies et la radioactivité est comptée ( voir tableau ci-après).
Fraction cpm/ml110021503700410005630614074808120091500101300117501247013130 Schéma tiré de : Biologie moléculaire et médecine - JC. Kaplan, M. Delpech - Médecine-Sciences Flammarion.
Questions :
1 - Quel est le type de chromatographie employé ici ? Donner son principe (une demi-page).
2 - Tracer le diagramme exprimant la radioactivité en fonction du n° de fraction. A quoi correspond le premier pic de radioactivité ? A quoi correspond le second pic ? Quelle(s) fraction(s) allez vous récupérer afin de vous en servir comme sonde radiomarquée ?
3 - Quel est le volume mort de la colonne ? Exercices de chromatographie : Exercice 14 : Un corps gras naturel constitué d'un mélange de triglycérides (TG), est soumis à l'action de la lipase pancréatique. Cette enzyme permet l'hydrolyse des acides gras en position 1 et 3 des TG, ce qui mène à des acides gras libres (AGL) et des 2-monoglycérides (2-MG), lorsque la réaction est totale. Les AGL ont été purifiés à partir du lipolysat par chromatographie échangeuse d'anions. Cette chromatographie permet, outre la fraction AGL, de purifier une seconde fraction constituée de glycérides neutres (GN). Différents échantillons ont été analysés en chromatographie sur couche mince (gel de silice). Le mélange de solvant utilisé, de polarités différentes, étant : éther de pétrole / éther diéthylique.
Les dépôts effectués sont :
1 : Témoin Triglycérides (TG)
2 : Témoin 1, 2-Diglycérides et 1, 3-Diglycérides (DG)
3 : Témoin Monoglycérides (MG)
4 : Témoin Acides Gras
5 : Echantillon milieu de lipolyse
6 : Echantillon Fraction Glycérides Neutres (GN) provenant de la chromatographie échangeuse d'anions
7 : Echantillon Fraction Acides Gras Libres (AGL) provenant de la chromatographie échangeuse d'anions
Questions :
1 - Donner en quelques lignes le principe de la chromatographie sur couche mince utilisée. En fonction de quel(s) critère(s) les différents composés vont-ils être séparés ?
2 - Ecrire la réaction mettant en jeu les TG et la lipase pancréatique.
3 - Analyser le chromatogramme ci-dessus. Est-ce que la réaction de lipolyse est totale ? Exercices de chromatographie : Exercice 17 : L'expression d'une protéine dans une bactérie (Escherichia coli le plus souvent) permet l'obtention d'un taux élevé de protéines pures. Le plasmide pET-15 de la société Novagen permet l'expression inductible de protéines recombinantes porteuses d'une extension N-terminale de 6 résidus histidine (His).
Cette séquence poly-His est capable de se lier à des ions nickel divalents (Ni2+) immobilisés sur un gel de cellulose ou d'agarose. Un extrait bactérien brut, après induction de l'expression de la protéine recombinante, peut être chargé directement sur une colonne contenant ce type de résine, et après une étape de lavage, la protéine retenue peut être éluée par de l'imidazole. Cette résine peut être régénérée et réutilisée.
 La figure représente un gel SDS-PAGE coloré par le bleu de Coomassie, où l'on a séparé les échantillons suivants :
1 - Lysat brut de bactéries transfectées par le plasmide pET-15 contenant un insert d'ADNc
2 - Protéines non retenues sur la colonne
3 - Lavage
4 - Protéine éluée
Questions :
1 - Quel est le type de chromatographie utilisé ? Expliquer le principe en une demi-page.
2 - Commenter le gel SDS-PAGE. Déterminer la masse moléculaire de la protéine éluée.Exercices de chromatographie : Correction exercice 16 :
1 - Le type de chromatographie utolisé ici est la chromatographie d'exclusion, ou tamisage moléculaire, gel filtration. (Faire un schéma).
2 - On peut tracer directement le nombre de cpm / ml en fonction du numéro des fractions, ou bien le nombre de cpm par fraction, en fonction du numéro des fractions (ce que l'on a fait ci-desous.
- Le premier pic correspond à des composés exclus du gel, donc de haute masse moléculaire : la sonde radiomarquée.
- Le second pic correspond à des composés retenus dans le maillage du gel d'exclusion : les nucléotides libres : le 32P dATP ainsi que le dCTP, le dGTP et le dTTP.
- Les fractions 3, 4 et 5 sont mélangées afin de constituer la sonde.
3 - Rappel : le volume mort est le volume d'élution des composés dont le diamètre est supérieur à celui des pores du gel d'exclusion. Ici, cela correspond à la quatrième fraction. Le volume mort est donc de 400 microlitres.
Exercices de chromatographie : Correction exercice 4 :
1 - Proportion des groupements diéthylaminoéthyls (DEAE : pKa = 9,4) chargés négativement aux pH : 2, 7, 9,4 et 12.
Le pH est donné par la relation suivante :
À pH = 2 := pH - pKa = 2 - 9,4 = -7,4 donc :  = 3,98 10-6 Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10-6.(A), on en déduit que (A) + 3,98 10-6.(A) = 100
(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 3,98 10-6)
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = environ 100 % et (B) = 0 %
À pH = 7 := pH - pKa = 7 - 9,4 = -2,4 donc : = 3,98 10-3 Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10-3.(A), on en déduit que (A) + 3,98 10-3.(A) = 100
(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 3,98 10-3)
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,996 % et (B) = 0,004 %
À pH = 9,4 := pH - pKa = 9,4 - 9,4 = 0 donc : = 1 Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A), on en déduit que (A) + (A) = 100
(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(2)
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 %
À pH = 12 := pH - pKa = 12 - 9,4 = 2,6 donc : = 398,1
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 398,1(A), on en déduit que (A) + 398,1(A) = 100
(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 398,1)
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,25 % et (B) = 99,75 %
Globalement, on peut donc constater qu'à un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements diéthylaminoéthyls se présenteront majoritairement sous forme acide (-NH+).
À l'inverse, à un pH supérieur au pKa (pH basique), les groupements diéthylaminoéthyls se présenteront majoritairement sous forme basique (-N)
2 - À pH = 7, on a pu calculer que la résine était à 99,996 % sous forme acide, chargée positivement.
Protéine :
Sérumalbumine
Uréase
Chymotrypsinogène
pHi :
4,9
5
9,5
Charge à ph = 7 :
négative
négative
positive
Ainsi, à pH = 7 la sérumalbumine et l'uréase sont chargées négativement, et seront donc retenues sur la colone. Le chymotrypsinogène ne sera pas retenus.
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